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CUT&RUN技术,助力绘制全基因组图

发布者:艾美捷科技    发布时间:2021-10-14     
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据今年3月份发布在ResearchSquare的一项研究,佛罗里达的科学家使用CUT&RUN技术,建立了眼球晶状体中HIF1α结合位点的全基因组图,文章链接:

CUT&RUN技术.jpg

 

我们知道,基因表达可以通过许多不同的机制进行调节,包括转录因子、组蛋白和其他DNA结合蛋白。绘制出DNA和蛋白质之间的相互作用图谱,对于理解基因激活或抑制以及其他细胞过程至关重要。

 

传统上,可以通过进行染色质免疫沉淀和测序(ChIP-seq)来分析这些相互作用。但是这种方法需要大量的起始材料才能产生足够强的信号以消除背景噪声,并且经常返回假阳性信号。同时,ChIP-seq还需要优化的超声处理来破碎染色质,这可能非常耗时并可能导致样品损失。

 

在最近的一项研究中,佛罗里达大西洋大学和国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所的科学家们利用CUT&RUN技术建立了一个功能性全基因组图谱,该图谱是一种称为缺氧诱导因子的蛋白质复合物的特异性结合位点—HIF1α,位于人眼的晶状体中。该团队表示选择CUT&RUN而不是ChIP-seq分析,是因为前者不需要DNA-蛋白质交联。此外,与ChIP-seq相比,前者成功实验所需的细胞计数极低。

 

正常而言,随着出生后眼睛的发育,提供健康血液供应的血管随着时间的推移开始萎缩。结果,眼睛中的氧气含量稳步下降,造成缺氧环境。HIF1α作为一种蛋白质复合物,可调节身体对缺氧环境的反应,这意味着它可以在晶状体细胞发育和体内平衡中发挥作用。

 

研究人员首先选择培养10天左右的大的WhiteLeghorn鸡胚胎中分离出晶状体细胞。收获的细胞用称为DMOG的HIF1α激活剂处理4小时,并用ConA包被的磁珠固定细胞核。之后,样品被分为两组:一组用HIF1α抗体处理,另一组用IgG抗体处理。将pA/MNase添加到样品中以启动碎裂。这种融合蛋白在与感兴趣的蛋白质相互作用的特定区域剪切DNA——在这种情况下,该蛋白质是HIF1α。通过向样品中加入CaCL2溶液来激活MNase,将DNA片段释放到上清液中。CUT&RUN片段用蛋白酶K处理1小时,然后分离DNA进行测序。

分离DNA进行测序.jpg

 

在HIF1α激活后,CUT&RUN在原代晶状体细胞中鉴定了8000多种HIF1α-DNA特异性复合物。他们能够使用ATAC-seq和RNA-seq验证并完成结合位点的映射,这表明这些复合物中约有1200个紧密聚集在染色质可及区域。进一步的分析揭示了526个基因的激活或抑制,其中116个基因在转录起始位点10kB内显示HIF1α结合位点。

CUT&RUN在原代晶状体细胞中鉴定了8000多种HIF1α-DNA特异性复合物.jpg

HIF1α结合位点.png

 

该实验中收集的数据有助于建立眼晶状体中HIF1αDNA复合物的第一个功能图,同时也强调了健康晶状体发育对HIF1α的需求。最终,CUT&RUN技术的这种成功应用,有助于接下来的大量研究,重点是了解某些蛋白质可能对基因表达的作用。


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EpiNext CUT&RUN Fast Kit结果展示.png

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